HPLC 常见问题解答，从此实验不迷路

A:

①建议检测前样品和流动相进行过滤。

②建议每天做完样品后及时进行清洗。

③常规检测：测试完后采用90%有机相冲洗30-45min，最后保存在纯甲醇或纯乙腈中。

④使用缓冲盐条件

a.等度条件：使用缓冲盐之前和之后都用过渡流动相以1ml/min流速冲洗45min

b.梯度条件：使用缓冲盐之前与初始流动相组成相同的过渡流动相以1ml/min流速冲洗45min。

如柱压升高，可以考虑采用高水相比例再对色谱柱进行冲洗30min，最后保存在纯有机溶剂中。

A: 

可以分以下这几种情况去排查：

①确认样品是否变质，如样品变质重新配样或测试样品的化学

②确认溶剂是否变质，如溶剂变质可以进空白溶剂或换其他品牌溶剂;

③检查柱子中是否有残留，并对柱子进行适当的冲洗;

④检查仪器管路或检测池是否被污染，如被污染需冲洗仪器。

A:

可能是以下这几种原因：

①柱温变化，控制实验室温度及柱温箱温度即可;

②流动相混合不均匀，使用HPLC溶剂，高纯度的盐和添加剂， 并确认多元流动相互溶性良好。流动相在使用前进行脱气;

③流通池被污染或有气泡，应清洗流通池，流动相在使用前脱气;

④检测器出口端被堵塞，应取出堵塞物或更换管路;

⑤柱平衡慢，尤其是流动相组成发生较大的改变，先用中等强度的溶剂冲洗柱子即可;

⑥柱子中有强保留物质以馒头峰样被洗脱，可以改变分析条件，使用保护柱，定期对柱子用强洗脱溶剂(在柱子使用范围内) 进行冲洗。

A: 

①样品体积过大：用流动相配样，总的样品体积小于第一峰的15%。

②在进样阀中造成峰扩展：进样前后排出气泡以降低扩散。

③数据系统采样速率太慢：设定速率应是每峰大于10点。

④流动相粘度过高：增加柱温，采用低粘度流动相。

⑤检测池体积过大：用小体积池，卸下热交换器。

⑥保留时间过长：等度洗脱时增加强溶剂含量，也可用梯度洗脱。

⑦柱外体积过大：将连接管径和连接管长度降至最小。

⑧样品过载：进小浓度小体积样品。

A:

①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理。

②比例阀失效，更换比例阀即可。

③泵密封垫损坏，更换密封垫即可。

④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法。

⑤系统检漏，找出漏点，密封即可。

⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

A: 

①柱温引起的峰前沿：升高柱温有助于增加流动相传质速率， 从而减少因静电作用引起的前沿，但温度过高会损伤色谱柱，当含有离子对试剂时，柱温小于等于40℃；

②样品溶剂与流动相极性差别大：增加流动相极性或样品用流      动相溶解；

③柱效降低：冲洗色谱柱，推荐使用保护柱;

④柱头塌陷或形成短路：更换手性柱。

A:

如果是正相涂敷型手性柱上的拖尾，先要了解样品本身的酸碱  性，如碱性手性化合物，在中性流动相中会产生峰拖尾，需要添加碱性添加剂，酸性则需添加酸性添加剂，添加剂的种类及  量请见使用说明书，对既有酸性结构又有碱性结构的两性化合物，必要时需同时添加酸性和碱性添加剂(流动相需手配以防仪器自动混合时盐析出)，或可考虑在流动相中加入甲醇(比例不大于流动相中另一种醇);如果是在键合柱正相模式上的拖尾，除以上方法外，还可以加入四氢呋喃、甲基叔丁基醚、二氯甲烷等强洗脱溶剂，或者换用其他流动相组成，如甲基叔丁基醚/甲醇、二氯甲烷/甲醇等;如果是反相柱上的拖尾，可换不同的缓冲盐溶液或有机相。

A:

旧柱“记忆效应”现象。色谱柱在使用过程中，因样品、杂 质、流动相添加剂等会在柱填料上进行吸附，无法完全除去而保留在柱填料上，形成填料的“记忆效应”。新柱和有记忆效应 的旧柱，手性环境会有略微不同，但如果遇到个别样品，与旧柱中被修饰的填料作用较好，由于新柱填料无法完全复制旧柱填料，可能出现旧柱比新柱分离好的情况。应对该问题，只能重新优化方法。在方法开发之初，也要做好柱子的耐用性考察。