【酸碱盐调节大揭秘】流动相选择,如何选用最佳pH调节剂和缓冲盐?

栏目:行业资讯 发布时间:2024-05-09
色谱方法开发时,一般选择常用的试剂、pH条件、缓冲盐、以及常用色谱柱的组合作为起始条件,然后对流动相比例进行一系列调整,直至获得比较满意的峰形和分离效果,如何正确科学地选择液相流动相呢?

色谱方法开发时,一般选择常用的试剂、pH条件、缓冲盐、以及常用色谱柱的组合作为起始条件,然后对流动相比例进行一系列调整,直至获得比较满意的峰形和分离效果,如何正确科学地选择液相流动相呢?




液相流动相选择原则


原则1:由强到弱

 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验,这样可以很快地得到分离结果,然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例


原则2:三倍规则

 每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量,保留因子约增加3倍,此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中,注意观察各个峰的分离情况。


原则3:粗调转微调

当分离达到一定程度,应将有机溶剂10%的改变量调整为5%,并据此规则逐渐降低调整率,直至各组分的分离情况不再改变。



小问题

RECRUIT

在配制流动相时我会遵循以上原则来加入一些添加剂来调节pH,常见的pH调节剂和缓冲盐对到底有哪些呢?

他们能够控制的pH范围又是多少呢?调节剂又应该从何说起?



常见的流动相




 酸类 



甲酸:通常使用的浓度在0.5%以下,能够让水的pH达到二点几的级别。


乙酸:酸性比甲酸略弱,通常使用浓度不超过0.5%,能够使水的pH到达到二点几的级别。


三氟乙酸:比较强的酸,使用浓度通常不超过0.5%,能使水的pH达到2以下,具有很大的离子强度及一定的离子对作用,是分析蛋白/多肽时常用的添加剂。


磷酸:这是一种不挥发性的酸,离子强度也不错,最重要的是,它在低波长紫外区无本底吸收。



缺陷

在于低波长下的紫外吸收,通常不建议在小于215nm波长的情况下使用,另外就是甲酸/乙酸具有比较大的挥发性,时间久了浓度会发生变化;而磷酸的缺点也不少比如不能兼容质谱方法,对色谱柱寿命影响大等。除此之外,还有一些其他的酸,比如硫酸,盐酸或者柠檬酸,但是都是非常罕见的使用了。




碱类 



碱类添加剂常见的是氨水和三乙胺,两者都能让水的pH到达非常高的水平,高到能把硅胶颗粒溶解掉。


缺陷

氨水和三乙胺的pH非常高,使用时必须要谨慎,另外就是这两种溶剂通常不太容易很干净,尤其是三乙胺,即使是色谱纯,放的久了也可能会由于变质导致污染。




盐类



甲酸盐:通常在液相色谱中常用的甲酸盐都是甲酸铵,而甲酸盐与甲酸配合,可以得到甲酸-甲酸铵缓冲体系,大概缓冲能力在pH3~4.5的范围之内,只要调节两者浓度的比例即可。


乙酸盐:常见为乙酸铵,在使用上,和甲酸盐十分类似,离子强度也不高。与乙酸配合的乙酸-乙酸铵缓冲体系pH的控制能力在pH4~5.5左右


磷酸盐 :常用的是磷酸的钠盐和钾盐,二者对pH的控制能力十分接近,只是离子强度稍有差异,绝大多数情况下是可以互换使用的,磷酸由于是多元酸,能够形成一氢盐和二氢盐,所以使用磷酸缓冲体系调节pH也是组合比较多,跨度比较大的,并且可以提供较高的离子强度。

磷酸-磷酸二氢钠pH1.2~3.1左右的范围;

磷酸二氢钠-磷酸氢二钠pH6.5~8左右的范围。



缺陷

甲酸盐:离子强度比较低,比较容易吸潮,称量的时候比较困难,在流动相里还可能挥发。

磷酸盐:流动相体系无法兼容质谱,并且对色谱柱损伤较大。



最后,比起单纯的酸碱,盐类,特别是具有缓冲能力的盐类可以很好的控制流动相的pH值,根据不同缓冲盐中两种盐的配比,可以很容易的配置出一定pH的缓冲溶液。上述的缓冲对能调节的pH范围指的都是在保持缓冲能力的范围之内,如果仅仅是调节pH的话,范围还可以再扩展一些。


此外,当分析物含有可电离官能团时,(在不同pH条件下可处于不同程度的电离状态,如伯、仲、叔氨基、羧酸基),pH条件将强烈影响分析物的反相保留状态,也会造成最强烈的选择性改变效果。


对于可电离的化合物,要获得最强的反相保留,分析物应尽可能的不带电或电离,此时分析物极性相对较小,在反相色谱柱上的保留就更强,中性化合物无任何可电离基团,不受pH影响。


酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反向保留最大,中性化合物的保留不受pH影响。


在选择流动相时,应避免在化合物分子的pKa值附近筛选pH条件,否则,pH值的微小变化都会导致保留和选择性的剧烈变化。保留曲线的平台区是分析方法耐用性较强的区域。流动相中有盐时,应确保盐不会析出。


采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时,通过调节流动相的pH值,以抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。