学习一下反向色谱柱的活化步骤和优化条件

反向色谱柱综合了硅胶和聚苯乙烯色谱柱的优点，同时避免了它们的缺点。以乙烯醇共聚物为基质的色谱柱，即使含有高载炭量也能保持表面湿润。多孔结构具有足够大的平均孔径，可获得理想的小分子化合物、多肽和小分子蛋白分离效果。在有机溶剂含量较高的流动相中，该柱的柱效与硅胶基质色谱柱相当，但在以碱性缓冲溶液为流动相时，分离效率超过硅胶柱。其显著特点之一是基质被烷基化填料的洗脱顺序，其保留能力与烷基链长度成正比。

反相色谱柱的活化步骤：

1、使用20倍柱体积的甲醇或乙腈来洗涤色谱柱是必要的。

2、如果流动相中含有缓冲盐，应该使用与流动相中盐的数量相等的超纯水和有机相来冲洗过渡。冲洗时的用量应为20倍色谱柱体积，然后使用含有缓冲盐的流动相来平衡色谱柱，用量应为20倍色谱柱体积或更多。

3、在流动相中不含缓冲盐时，应该使用容量为柱体积的20倍或更多的流动相平衡色谱柱。

4、在压力基准稳定的情况下，如果不稳定，就可以延长平衡时间。

改善反相色谱柱的操作参数：

一旦确定了色谱柱规格、适当的固定相柱填料、流动相溶剂和添加剂，即可开始进行方法优化。方法的优化取决于具体目标。若需开发质量控制方法，可能需要采用较少可变因素的等度分离方法。若目标是实现较高的分离度，而节省分析时间并非首要考虑，则可选择较长的柱子实现更好的组分分离。若分离速度至关重要，则应选择较短的柱子和更高的流速。对于含有多种目标化合物的复杂样品，使用等度分离可能不足以解决问题，应考虑开发和优化梯度方法。

根据惯例，被称为“流动相A”的是水相溶剂和在反相色谱中相对较弱的溶剂，“流动相B”则是具有更高和更强溶剂成分的。在反相色谱模式下，增加B的百分比通常会导致保留时间缩短。值得注意的是，在实际分析方法开发之前，许多人采用“试错”方法来发展HPLC方法，不断尝试不同流动相条件，以找到较佳条件。