色谱柱的选择原则有哪些

栏目:行业资讯 发布时间:2022-09-09

在高效液相色谱分析中,色谱柱的选择直接影响分离效果。选择合适的色谱柱可以缩短方法开发所需的时间,使方法更加稳定。

现在有各种各样的商业液相色谱柱。根据色谱柱的参数,可以提供初步的选择,但由于不同仪器制造商的填充技术和键合技术不同。即使是这样C18柱,不同品牌.同一品牌的不同系列有不同的功能,能够耐受性低pH值的.有耐高温的.适用于碱性样品等。

要做出适当的选择,必须对此有一定的认识和理解。

原则一:看物理性质

柱长,内径,如250*4.6mm。。一般柱长为2-250mm,柱越长,分离度越高,但柱压越高,分离时间越长;然而分离度与理论塔板数的平方根成正比,因此增加柱长并不是最有效的分离方法。一般来说,150mm.5um可提供足够数量的塔板。

粒径影响色谱分离。粒径越小,分离越快,柱效应越高,但柱压力越高,柱容易受到污染,导致柱寿命缩短。常用分析柱通常使用5um填料、复杂的多组分样品通常用于分离.5um粒径,较大的内径制备色谱柱通常使用较大的粒径。如果固定阶段的选择正确,但分离不够,那么选择较小的粒度填充是非常有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3.5um的色谱柱的背压却是5um的2倍,因此如何选择填料粒径需要根据现实情况而定。

孔径,60A,100A,120A,300A等待。孔径小,孔隙率高,比表面积大,碳负荷高;色谱柱填充孔径应与分子尺寸相匹配,以确保分子自由进出填充孔,并与孔内表面键合相分离。通常,孔径直径是分子直径的3倍以上使用80-120A,大分子使用300A。

通常有球形和不规则形状的颗粒形状,当使用粘度较大的流动相时,球形颗粒可以降低柱压,延长色谱柱的使用寿命。

比表面积,是指每克填料的表面积,如180m2/g—350m2/g,与粒度和孔隙率有关;如果比表面积较大,则会增加样品与键合相之间的反应,增加保留率和分离度;如果比表面积小,则可以缩短分析时间和平衡时间。如果比表面积大或小,这并不比表面积好。有必要选择合适的比表面积。

原则二:看化学性质

硅胶基质:最常见的基质,强度高,易于化学修饰,但使用pH有限值(一般为2-8,特殊装饰可达到1-12)。

聚合物基质:聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯,化学稳定,应用广泛,pH范围广,疏水性强,蛋白质等样品分离效果好;但强度较小,有机溶剂可能导致聚合物膨胀和损伤,批次重复性差,商业色谱柱不多,一般价格较高。

荷载量:基质表面键合相的比例,荷载量高,保留增加,适合分析非极性化合物。

键合相:不同的键合试剂对化合物有不同的选择,一般长链的烷基键合相不同。(C18.C8)比短链的(C4.C3)稳定性;与极性键合相比,非极性键合相(-NH2)稳定。

密封端:用短链关闭暴露的硅羟基键,减少残留的硅醇基,减少因组分和酸性硅羟基反应引起的色谱峰尾现象。特别是对于极性样品,未密封的色谱柱分离效果较差。

原则三:看正相,反相色谱

目前市场主要以反相色谱为主,约占80%。在了解了色谱柱的基本知识之后,色谱柱的选择就解决了

原则四:根据柱长和内径选择

长度选择:柱越长,柱效越高(n值越大,柱越长,分析时间越长。250-300mm这是最常见的柱长。超过一半的实验室工作使用这种规格的柱子,通常用于分离l中等到复杂混合物从0到50组分;500-600mm,需要较高分辨率的应用程序,通常用于分离超过50个组件或复杂样品,其中含有难以分离的物质。

内径:立柱效率与立柱半径的平方成反比。内径越小,立柱效率越高,但内径越大,立柱容量也越大,允许的样本量越多。当样品输入量超过立柱容量时,由于立柱中的每个理论板无法建立真正的平衡,会导致色谱蜂畸变,降低立柱分辨率,重现性差。因此,对于复杂准确分离的复杂样品,必须使用小内径柱。另一方面,如果样品中存在不同浓度的组分化合物,则必须使用内径较大的柱来增加样品容量。目前,实验室中使用的最常见的柱内径一般为4.6mm。

一般选择原则:分析大分子量化合物,选择大孔径色谱柱;高分子量化合物pH为了提高峰型,延长色谱柱的使用寿命,应选择高封端或特殊封端的色谱柱。