HPLC的检测和定量方法

图 1. 浓度与响应的关系示意图

其中，A 是峰面积，b 是分析物校准曲线的斜率，有时也称为灵敏度。不同化合物的校准曲线斜率 b 值可能不同。因此，通常需要为每种必须定量的分析物生成校准曲线。

为了生成校准曲线，可以使用分析物的纯化合物作为校准标准品（以下简称校准品），制成不同浓度的溶液。校准品与样品无关，在这种情况下，校准品可视为外部校准标准品（外部校准标准品与样品在不同的批次中进行分析，而内部校准标准品与样品一起添加和分析）。

在许多实际应用中，最好是在不含分析物的空白样品中加入不同含量的校准化合物来进行校准（即含基质的标准品）。这种方法可以使含有校准标准的样品的分析尽可能接近真实样品的分析，并可以在分析中减去基质的整体影响。对于结构相似的化合物，有时只使用其中一种化合物的校准曲线，并根据相同的校准品对不同的化合物进行定量。但不建议使用这种方法，只有在无法获得所有化合物的校准标准品时才可使用。

有些线性定标不通过原点，因此必须使用以下形式的关系来计算峰面积：

大多数 HPLC 检测器的峰面积与样品浓度呈线性关系。但有时也会遇到非线性关系。非线性可能是由于检测器过载造成的，而检测器本来应该具有线性响应。此外，极低浓度的分析物也可能导致非线性响应。因此，必须对整个浓度范围进行线性验证，尤其要注意极低浓度和极高浓度。荧光检测的线性范围仅对低浓度有效。荧光和化学发光检测器有时需要使用非线性校准曲线。这样仍然可以直接根据非线性校准曲线或使用相应的关系式计算浓度。不过，在一般情况下，线性校准曲线更为可取。

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在许多定量技术中，每次色谱分析都会引入内标物（以下简称内标）。内标是实际样品中不存在的化合物，在分析过程中，在选定的时间点加入一定量的内标，用于验证重现性、计算样品损失等。内标的选择必须使其在分析过程中的表现与分析物尽可能接近，不干扰分析物的测定，并提供一个便于积分的色谱峰等。

除了在样品中加入内标（如通过样品制备过程）外，有时在处理过的样品中加入色谱标准品也很有用。这种标准品是一种内标，仅用于验证色谱过程是否正常；它存在于色谱仪的处理过的样品中。